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HPLC-UV-FLU法同时测定血浆中三种抗抑郁药物浓度

作者:时间:2008-08-29点击数:

HPLC-UV-FLU法同时测定血浆中三种抗抑郁药物浓度

魏世杰1,文友民1,党宏万1#(1.宁夏医科大学附属医院药剂科)

摘 要

目的:建立一种快速灵敏的同时测定血浆中文拉法辛、氟西汀、舍曲林浓度的HPLC法,监测这三种药物的血药浓度,为临床用药提供依据。方法:以异丙嗪为内标,样品碱化后经液-液萃取,用phenomenex-C18反相色谱柱(250 mm×4.6 mm,4μm)进行分离,以乙腈:磷酸缓冲液(50mmol·L-1 NaH2PO4用H3PO4调节pH=2.5)=35:65为流动相,流速:1.2 mL·min-1;柱温:40℃;荧光检测文拉法辛,激发波长276 nm,发射波长598 nm,紫外检测氟西汀和舍曲林,检测波长为200 nm。结果:文拉法辛在5~1000μg·L-1的线性关系良好,氟西汀在40~1000μg·L-1的线性关系良好,舍曲林在20~800μg·L-1的线性关系良好,相关系数均大于0.998,日内、日间变异系数均小于10 %,提取回收率均大于70 %,方法回收率均大于90 %。结论:本法简便快速,灵敏可靠,可用于治疗药物监测、中毒分析及药物动力学研究。

关键词文拉法辛;氟西汀;舍曲林;高效液相色谱

文拉法辛、氟西汀、舍曲林是目前临床常用的新型抗抑郁药。文拉法辛(Venlafaxine)是第一个5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素再摄取双重抑制剂,它对肾上腺素能、胆碱能及组胺受体无明显亲和力,其不良反应较少。氟西汀(fluoxetine)、舍曲林(sertraline)是5-羟色胺重摄取抑制剂,由于它没有抗胆碱及心血管副作用,临床上广泛用于抑郁症、强迫症和神经性贪食症的长期治疗,但其半衰期长,血药浓度个体差异大,代谢产物对肝药酶CYP2D6[1]有抑制作用,并且影响自身代谢,药动学呈非线性动力学特征。因此,临床上须对以上三种药物进行治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring, TDM),为临床合理用药提供科学的依据。

国内外文献报道多采用HPLC-FLU法、HPLC-UV法、HPLC-MS法[2-5]分别测定上述三种化合物,由于质谱检测器价格昂贵,一般实验室难以满足要求。本实验参考相关文献报道,建立了一种简便、灵敏、准确、经济的反相高效液相色谱法同时测定血浆中上述三种药物。

1 仪器与试药

Agilent1200高效液相色谱仪(紫外检测器、荧光检测器);文拉法辛对照品(批号100518-200401)、舍曲林(批号100702-200401)均购自中国药品生物制品检定所;氟西汀(057K1516)购自sigma公司;内标异丙嗪(上海禾丰制药有限公司070902);血浆购于本院输血科;乙腈、甲醇为色谱纯;其他试剂均为分析纯;水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:phenomenex-C18(250 mm×4.6 mm,4μm),保护柱:Agilent ZORBAX SB-C18(12.5 mm×4.6 mm,5μm);流动相:乙腈:0.05 mol·L-1磷酸盐缓冲液pH 2.5=35:65;流速:1.2 mL·min-1;柱温:40℃;荧光检测文拉法辛,激发波长276 nm,发射波长598 nm;紫外检测其余两种药物,检测波长为200 nm。

2.2 溶液配制

分别精密称取文拉法辛、氟西汀、舍曲林对照品适量置25 mL棕色容量瓶中,甲醇溶解并定容至刻度,冷藏备用;精密称取异丙嗪适量,用纯化水溶解,配制成浓度为1.25mg•L-1的内标溶液,冷藏备用。

2.3 血样样品的处理

取0.5 mL血浆置入10 mL玻璃管中,加入50μL内标液旋涡振荡3 min,再加入2 mol·L-1NaOH 400μL旋涡振荡3 min,加入正己烷-异丙醇(v:v=98:2)5 mL,旋涡振荡3 min,3×103r·min-1离心10 min,移取上清液55℃氮气流吹干,残渣加100μl流动相溶解后,进样6Oμl。在上述色谱条件下测定并记录色谱图,见图1.

图1 高效液相色谱

A.空白血浆;B.含对照品的血浆;C.部分病人血样

1-为文拉法辛;2为内标;3-为氟西汀;4-为舍曲林

Fig 1 HPLC

A.blank plasma;B.standard solution in blank plasma;C. patient samples

1-venlafaxine;2-internal standard;3-paroxetine;4-sertraline

2.4 血浆标准曲线制备方法

在10 mL玻璃管中依次加入不同浓度的各对照品溶液,在55℃氮气流吹干,加入空白血浆0.5mL,旋涡振荡3 min,配成不同浓度的三种化合物的血浆浓度系列。按“2.3”项下操作。以对照品血浆浓度(μg·L-1)为横坐标,对照品峰与内标峰面积的比值为纵坐标,建立回归方程,结果见表1。

表1 回归方程与线性范围

Tab 1 Regression equations and calibcation range

化合物 线性方程 相关系数/r 浓度范围/μg·L-1 定量下限/μg·L-1

文拉法辛 Y=22.004X+0.086 0.998 5~1000 2.5

氟西汀 Y=5.944X+0.018 0.999 40~1000 20

舍曲林 Y=13.816X+0.003 0.998 20~800 10

2.5 回收率与精密度试验

2.5.1 萃取回收率。在10 mL玻璃管中依次加入低、中、高各对照品溶液,在55℃氮气流吹干,加入空白血浆0.5mL,旋涡振荡3 min,按血样处理方法对样品进行操作,测定得峰面积A;同法另取以上三个浓度的各对照品溶液,氮气流吹干后用流动相溶解,进样,得峰面积A,比较A/A,计算萃取回收率,结果见表2。

2.5.2 方法回收率。在10 mL玻璃管中依次加入低、中、高各对照品溶液,在55℃氮气流吹干,加入空白血浆0.5mL,旋涡振荡3 min,按血样处理方法对样品进行操作,测定,以回归方程计算方法回收率,结果见表2。

2.5.3 日内、日间精密度。在10 mL玻璃管中依次加入低、中、高各对照品溶液,在55℃氮气流吹干,加入空白血浆0.5mL,旋涡振荡3 min,按血样处理方法对样品进行操作,日内精密度按低、中、高3个浓度分别在同一天的不同时间测定5次进行计算,日间精密度按3个浓度在连续5天重复测定计算,计算日内和日间精密度,结果见表2。

表2 萃取回收率、方法回收率(±S,n=5)与日内日间变异结果(n=5)

Tab 2 Extractive recovery and methodological recovery , within-day and between-day RSD(n=5)

化合物 浓度/μg·L-1 萃取回收率/% 方法回收率/%

日内RSD/% 日间RSD/%

文拉法辛 10 79.9±8.6 105.2±4.8 4.24 8.27

venlafaxine 40 88.2±9.8 99.3±5.5 5.54 7.84

1000 85.32±6.7 102.5±5.7 3.57 5.87

氟西汀 50 68.75±11.4 99.3±8.7 9.75 9.12

Fluoxetine 200 75.2±9.1 104.2±8.5 7.78 7.52

800 78.88±5.2 101.2±4.2 5.45 6.58

舍曲林 20 77.4±4.6 94.7±5.1 8.57 6.36

Sertraline 100 81.9±6.8 98.3±6.3 6.88 5.44

800 88.7±5.5 102.2±4.3 5.24 4.77

3.5 稳定性实验

按照标准曲线制备方法分别配制各种化合物中浓度的混合血样20 mL,分为若干份置于-26℃的冰箱中,分别在0小时、24小时、一周、一月按“2.3”项处理并测定药物的浓度(n=5),三种药物测得浓度值RSD均小于10.0%。

3.6 病人血样分析

共收集到5位抑郁症患者的样本,均未同时服用上述三种药物,由于肝药酶CYP2D6的作用,使得该类药物在个体间代谢存在较大的差异,所服药物及其血药浓度见表3。

表3患者血药浓度测定结果

Tab 3 Plasma concentrations in depressed patients

样本序号 性别 年龄/y 所服药物 药物剂量/mg·day-1 实测浓度/μg·L-1

(Sample NO.) (Gender) (Age) (Drug administered) (Drug dose) (Concentration)

1 男 40 舍曲林 50 79.51

2 女 65 氟西汀 20 73.79

3 女 60 文拉法辛 150 25.86

4 男 30 舍曲林 50 150.30

5 女 20 舍曲林 100 41.12

4讨论

血浆样品碱化后对Waters公司生产的Sep-pak固相萃取小柱进行固相萃取和经典液液萃取法分别进行了考察。分别用三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、正己烷/异丙醇等溶剂作为提取溶剂,在不同pH值条件下从血浆中提取该组药物,加入异丙醇来减少玻璃器皿内壁对药物的吸附作用。结果表明正己烷:异丙醇(98:2)在pH 10.0条件下回收率与固相萃取法提取回收率差别不大。

对三种药物分别在190 nm~400 nm进行全波长扫描,由于200 nm处吸收信号较强,为达到所要求的定量限,故选择200 nm为检测波长。文拉法辛是一种强荧光物质,选择灵敏度更高的荧光检测器对其进行检测。本实验最终采用紫外检测器与荧光检测器串联同时检测三种药物。应用本法对服用新型抗抑郁药物的病人进行治疗药物监测,对中毒病人可迅速、准确地一次性分别进行定性定量分析,以提高药物治疗效果,提高抢救的成功率。

参考文献(略)

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