外科病人术后预防血栓口服华法林的血药质量浓度监测

刘瑢 杨晓英

摘要:目的 建立一种简便、快速的方法测定人血浆中华法林的含量。方法 采用ZORBAX Eclipse XDB-C8色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为0.01 mol·L-1磷酸二氢钾溶液-乙腈(55∶45);流速为1.0 mL·min-1;检测波长为308 nm。结果 华法林保留时间约为6.2 min,线性范围为248~3 720μg·L-1,r=0.999 3,华法林的高、中、低质量浓度日间、日内RSD均在10%以下,回收率大于90%。结论 该法简便、快速,结果准确,可用于临床上患者血浆中华法林药物浓度的监测。

华法林是临床使用广泛的双香豆素类口服抗凝药,可预防和治疗血栓栓塞性疾病,是目前临床最常用的长效抗凝剂。但因其在应用过程中个体差异大,影响华法林抗凝效果的因素很多,包括种族、遗传、饮食、疾病状态及合用药物等,临床应用过程中难以掌握和控制。因此,准确使用华法林,发挥最大抗凝效果,避免出血等并发症的风险,进行个体化用药是势在必行的手段。笔者建立一种高效液相色谱法测定血浆中华法林药物质量浓度,对外科病人术后预防血栓口服华法林钠进行血药质量浓度监测,同时测定凝血酶原国际标准化比值(INR),

探讨华法林血药质量浓度与INR值之间的关系,确保抗凝疗效,减少并发症。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1100型高效液相色谱仪(配备有自动进样器,四元梯度泵,柱温箱,二极管阵列检测器)；梅特勒十万分之一电子天平；12孔位氮吹仪。

1.2 材料 华法林对照品(美国Sigma公司,201-377-6)；甲醇、乙腈为色谱纯(美国天地公司)；磷酸二氢钾为分析纯(北京化学试剂公司,批号20070918)；水为娃哈哈纯净水；空白血浆(宁夏回族自治区血液中心)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 美国Agilent色谱柱ZORBAX EclipseXDB-C8(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相:0.01 mol·L^-1磷酸二氢钾-乙腈(55∶45);流速:1.0 mL·min-1；检测波长:308 nm;柱温:30℃；进样量:20μL。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取华法林对照品12.4 mg,用甲醇溶解并定容至10 mL的棕色量瓶中,摇匀后于4℃下避光密封储存,临用前以甲醇稀释至所需质量浓度。

2.3 供试品溶液的制备 精密吸取血浆100μL,涡旋混匀30 s,加乙腈200μL,涡旋萃取3 min,14 000r·min^-1高速离心10 min,吸取上清液20μL进样,记录色谱图。

2.4 方法的专属性 吸取空白血浆、空白血浆加对照品、患者样品各100μL,按2.3项下操作,记录色谱图。结果表明,在上述色谱条件下,华法林的保留时间在6.2 min左右,华法林与血浆中的内源性成分

能得到良好分离。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取质量浓度为12.4μg·mL^-1华法林对照品溶液2,5,10,15,20和30μL吹干后,加空白血浆100μL,配制成一系列质量浓度标准血浆溶液,按2.3项下处理,记录色谱图,以华法林血浆质量浓度C(μg·mL-1)为纵坐标,以峰面积A为横坐标,进行线性回归,其回归方程为:A=11.099C-0.778 5,r=0.999 3(n=6)。结果表明,华法林质量浓度在248~3 720μg·L-1范围内呈良好线性关系,以S/N≥3计算,最低检测限为124μg·L-1。

2.6 精密度实验 配制低、中、高3种质量浓度的血浆样品,按2.3项下操作,以1 d内每种5个样品测得的华法林质量浓度计算日内精密度,连续测3 d得的华法林质量浓度计算日间精密度。结果高、中、低3种质量浓度的日内RSD分别为3.4%,5.8%和3.7%,日间RSD分别为6.7%,8.8%和9.6%。

2.7 稳定性实验

2.7.1 血浆样品处理前稳定性考察 分别精密吸取不同体积的华法林对照品溶液吹干,加入一定体积空白血浆配制成低、中、高3种质量浓度的血浆样品,按不同存放条件放置。0 h,室温放置6 h,反复冻融2次,冷冻1周后,按2.3项下操作,记录3种质量浓度的峰面积,计算不同放置条件下峰面积与0 h峰面积的偏差,均在±5%之内,表明血浆样品处理前各放置条件下样品稳定性良好。

2.7.2 血浆样品处理后稳定性考察 分别精密吸取不同体积的华法林对照品溶液吹干,加入一定体积空白血浆配制成低、中、高3种质量浓度的血浆样品,按2.3项下操作,于室温下放置0和4 h,4℃条件下放置48 h后进样分析,记录3种质量浓度的峰面积,计算在血浆样品处理后不同存放条件与0 h峰面积的偏差,均在±5%之内,表明血浆样品处理后各放置条件下样品稳定性良好。

2.8 提取回收率 分别精密吸取不同体积的华法林对照品溶液吹干,加入100μL空白血浆配制成低、中、高3种质量浓度的血浆样品各5份,按2.3项下操作,记录所得峰面积记为A1；同时按上述操作再分

别精密吸取不同体积的华法林对照品溶液吹干后加入100μL水,配制成低、中、高3种质量浓度水溶液各5份,按2.3项下操作,所得峰面积记为A2。以(A1/A2)×100%计算提取回收率(%)(n=5),高、中、低3种质量浓度的平均提取回收率分别为93.7%,99.7%和107.2%,RSD分别为5.7%,12.6%和8.5%。

2.9 临床样本测定

2.9.1 一般资料 监测18例(次)确诊为下肢静脉血栓形成的骨科患者,口服华法林钠抗凝治疗。所有患者均被告知采血目的及实验方法,并获得知情同意。

2.9.2 样品采集 连续用药3 d以上,于次日晨9:30服药前采集血样2~3 mL,3 000 r·min-1离心5min,分离血浆,-20℃冰箱保存待测。同时采集做凝血全套,记录INR值。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 查阅相关文献,华法林在210和308 nm波长处有最大吸收,利用二极管阵列同时检测2个波长下华法林的峰形和峰面积及杂质干扰情况。研究结果发现,210 nm条件下,峰面积响应值高,但有内源性干扰；而在308 nm波长下,峰形最好,杂质干扰最少,灵敏度也较好。在流动相比例的选择中,发现流动相的比例在45：55时色谱峰较好且峰形不受其他杂质峰干扰,保留时间在6.2 min左右,分析时间短,适用于临床样本测定。提取方法的选择中,分别采用甲醇沉淀蛋白、乙腈沉淀蛋白、乙酸乙酯沉淀蛋白和氯仿与甲醇混合沉淀蛋白4种方法进行提取,结果发现用乙腈沉淀蛋白进行血浆样本处理,方法简便,提取回收率高,大大缩短了提取时间,可快速测定临床样本,保证结果能及时反馈给临床。

3.2 稳定性考察 文献报道,华法林对照品溶液在4℃条件下可稳定6个月。本研究考虑到临床送样,分别对华法林血浆样品在处理前和处理后不同放置条件下进行了稳定性考察,结果各放置条件下华法林稳定性良好,能保证实验数据可靠。

3.3 线性范围 本研究方法的线性范围为248~3 720μg·L-1,从测定的18例(次)临床样本来看,多数样本测定结果在线性范围内,仅有2例低于定量下限,说明线性范围能适用于临床样本的测定。

3.4 华法林血药浓度与INR值的关系 我院INR参考范围在0.8~1.5,对18例(次)患者口服华法林钠后的血药质量浓度与INR的关系进行分析,其中11例测定的INR值在0.8~1.5范围内,占61%,对应的血药质量浓度范围在209~698μg·L-1。在18例监测血药质量浓度及INR值中,有1例女性患者,69岁,共监测了5次,最大的INR值为2.35,其对应的血药质量浓度为1 110μg·L-1,同一个体的血药质量浓度随INR值的增加而升高。但由于临床例数较少,监测时间较短,不能确定二者之间是否存在线性相关性,尚需进一步研究评价。但有研究提

示[5],具有抗凝适应证的65岁以上老年患者服华法林抗凝,其出血并发症的发生与抗凝强度密切相关。因此老年患者用药的个体化应更为谨慎。

----摘自《西北药学杂志》 2011年第5期